【目的要求】

1． 掌握米-曼氏方程式的应用,熟悉求Km值及Km值的意义；
2． 掌握旋光法测定化学反应动力学参数的原理和实验操作技术；
3． 通过求酵母蔗糖酶的Km值进一步加深对林-贝氏方程式的理解应用

【基本原理】

　　酶是生物体内产生的具有极高催化活性和选择性的蛋白质类物质，它的催化活性比其他催化剂高10-1~10-13倍，酶催化反应一般是在常温、常压、近中性的条件下进行，反应酶的用量一般很少。一种酶一般只能催化某一类特定的反应。

　　米哈得－门顿(Michaelis-Menten)、布里格斯(Briggs)等详细研究了酶催化反应动力学，认为酶催化反应机理为

　　　　　　①

　　　　　②

　　反应式中，Ｓ为反应物（也称底物）；Ｅ为酶；ＥＳ为底物和酶形成的中间化合物；Ｐ为产物。反应①很快达到平衡，反应②是控制步骤。用稳态法处理，该反应的速率 r 表达式为

　　　　(1)

　　若令，则上式(1)变为：

　　　　(2)

　　kM　即为米氏常数，在指定的条件下，每一种酶均有特定的kM值，与浓度无关它是表征酶特性的一个重要的动力学参量。若酶的原始浓度为[E]0,反应达到稳定太后有

[E]0＝[E]＋[EＳ] 　　　 (3)

　　(4)

　　则(2)式变为　　　　　　　　　　(5)

式(5)就是表征酶催化反应动力学著名的米哈利－门顿方程。在整个反应过程中，一般[E]0是不变的，r仅是底物浓度[S]的函数。如以r为纵坐标，[S]为横坐标，作图可得酶催化反应速率曲线，如右图。 　　当[S]很大时，kM　»[S]，式(5)变为 r = k2[E]0，反应速率与[S]无关，并且达到最大值rmax,代入(5)可得 　　　(6) 　　则当　r=(1/2)rmax　时，kM＝[S]，即米氏常数等于最大反应速率一半时的底物浓度。若对(5)式积分并除以时间t，可得

　　　(7)

　　式(7)中，[S]0为底物初始浓度，若以作图，可得一斜率为kM，截距为k2[E]0的直线。

　　本实验用的蔗糖酶是一种水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，反应式如下：

　　由于反应时水是大量的，在整个反应过程中浓度保持恒定，所以该反应动力学公式符合米哈利—门顿方程。可以用式(7)求出其kM值。便在反应进程中，快速分析反应物本身的浓度是困难的，必须将其转化为其他可测量参量。由于蔗糖及其转化产物均具有旋光性，而且它们的旋光能力各不相同，帮可以利用反应过程中旋光度的改变来度量反应进程。

　　若以０表示实验开始时蔗糖溶液的旋光度，t表示在任意时刻t时的旋光度，表示反应完成后的旋光度，则蔗糖的原始浓度[S]0与(０-)成正比(见《蔗糖水解反应速度常数的测定》)，t时刻溶液中剩余蔗糖的浓度[S]与(t-)成正比,则式(7)可变为

　　　　(８)

　　若将　对　作图，应得一直线，其斜率为米氏常数kM，截距为k2[E]0　。

　　另外，酶反应速度除与底物浓度、酶浓度有关外，还与温度、离子强度、pH值和其他干扰物质（如微生物、抑制剂）等因素有关，因此在实验室中必须严格控制这些条件。

【仪器和试剂】

　　1.仪器 ： 旋光仪　　１台　　　旋光管　１套　　记时器（秒表）　１块　　　　　

　　　　　　　超级恒温槽　　1个　　锥形瓶（１００ml） ２个　　托盘天平　　１台

　　　　　　　烧杯（500ml，1000ml）　各１个　　移液管（25ml）２支 　　移液管（１ml）２支

2.药品 ：　0.10mol/L/乙酸－乙酸钠缓冲溶液

　　　　蔗糖贮备液：将200g蔗糖溶于500ml二次蒸馏水中，若溶液浑浊则需要过滤，然后移入1000ml容量瓶中，备用。

　　　　蔗糖酶贮备液：在100ml锥形瓶中，加入50ml二次蒸馏水，10g新鲜酵母，0.8g乙酸钠，搅拌至全部溶解，加入1.5ml甲苯，封口，摇动10min后，于37℃保温60h。取出后用1.6ml　4.0mol/L乙酸调pH至4.5左右，用转速为3000r/min的离心机离心0.5h。该混合物被分为三层，中层即为粗制酶液。取出后将其稀释至蔗糖水解反应起始5min内，须给出旋光度的变化值为0.5~2度，方可备用。

【实验步骤】 　　

　　 (1)、０的测定　

　　在清洁干燥的100ml烧杯中，依次加入25ml蔗糖贮备液、1ml二次蒸馏水、25ml0.10mol/L乙酸－乙酸钠缓冲溶液，在电磁搅拌器上充分混合，并恒温至测量温度，用少量上述混合液清洗旋光管二次，然后装满放入已怛温的旋光仪中，读取四次旋光度。取其平均值。记为０。

　　(2)、t的测定

　　在另一清洁干燥的100ml烧杯中，依次加入25ml蔗糖贮备液，25ml0.10mol/L乙酸－乙酸钠缓冲溶液，在电磁搅拌器上混合均匀后，恒温至实验温度。在快速搅拌下，加入1ml蔗糖酶贮备液，并开始计时。充分混合后，用少量溶液很快地清洗旋光管两次，然后装满放入已恒温的旋光仪中，并尽快地读取第一个数据（距加入酶的时间尽量不超过去时１～２min），在反应开始后的起始10min内，1min测量一次，此后，3min测量一次，直到旋光度变为负值。

　　(3)、的测定

　　测定完后，将旋光管从旋光仪中取出，放入40℃的恒温水浴中，每20min从水浴中取出，擦干后测量旋光度，然后再放入水浴中，重复这一过程，直到连续两次读数的差值在仪器测量误差范围内为止。取平均值作为。

【数据记录与处理】

实验数据记录　　

室温： 　　　℃　　大气压力：　　　　　　pa　

乙酸－乙酸钠缓冲溶液　　　　　　　

(1)、实验数据记录入计算处理

0 　　　　　　　； 　　　　　　　；[S]0　 　　　　　　　　　

序号	反应时间/min	t
1	0	0	0	0
2	0	0	0	0
3	0	0	0	0
4	0	0	0	0
5	0	0	0	0
6	0	0	0	0
7	0	0	0	0
8	0	0	0	0
9	0	0	0	0

(2)、以　对　作图，由该直线斜率求米氏常数kM。

(3)、由该直线截距，计算最大反应速率rmax＝k2[E]0，

【思考与讨论】

　　(1)、为什么本实验中，没有对旋光仪进行零点校正？这样会引入实验误差吗？

　　(2)、为什么在实验前必须对所使用的玻璃仪器进行高温消毒？

【注意事项】

　　实验所用酶要求比较严格，制备贮备酶要求使用新鲜蔗糖酶。且应该在低温下保存备用。